做细胞超微结构研究的人都知道，TEM 成像的质量七成取决于制样。切片漂不漂亮、铜网捞得匀不匀、染色是否充分——每一步的细节都在最终图像里一览无余。生物样品含水量高、结构脆弱，和材料样品完全是两个逻辑，制样流程有其特殊性。
制样的核心挑战
生物细胞的基本特征是含水量极高(约 70%~80%)，而 TEM 成像需要在高真空环境下进行。直接送脱水状态的细胞进去，结构早就塌缩变形了。所以生物样品 TEM 制样的核心任务，是在保持细胞原有超微结构的前提下，用树脂包埋替代水分，最终得到可供超薄切片的固体样品。
取材：越快越好
取材是整个流程里最考验操作者经验的一步。目标组织的离体时间必须控制在 1 分钟以内——超过这个时间，细胞开始自溶，内质网、线粒体等膜性细胞器的超微结构会迅速退化。
实际操作中常用两种策略：一是直接在解剖液(戊二醛或其他固定液)中进行取材，固定和取材同步完成;二是快速取出组织后立即切成 1 mm³ 左右的小块，转移到固定液中。对于培养细胞，贴壁细胞可以直接在培养皿里加固定液固定，避免离心造成的机械损伤。
固定液浓度是另一个需要注意的参数。常规戊二醛浓度 2.5%，多聚甲醛 4%，两者联用可以兼顾渗透速度和固定深度。如果样品特别致密(比如植物细胞壁)，可以适当降低浓度增加渗透性。
固定与后固定
前固定(醛类)的作用是快速终止细胞内的生化反应，固定蛋白质的交联结构。固定时间根据样品大小而定：1 mm³ 的块体需要 2~4 小时;细胞悬液 30 分钟即可。
后固定用锇酸(OsO₄)，浓度 1%，主要固定脂类成分，脂双层结构靠它固定。锇酸是剧毒挥发性物质，操作必须在通风橱中进行，且样品管要封紧——锇酸挥发后样品会变黑变脆，切片质量严重下降。
脱水与渗透
脱水用梯度乙醇或丙酮，从 50% 开始逐级升高到 100%(通常 15 分钟/步)，最后用无水丙酮彻底置换水分。100% 丙酮处理完后，开始渗透树脂。
环氧树脂(Epon 812 或 Spurr)的渗透是整个流程里最耗时的环节。通常用丙酮:树脂 = 3:1 → 1:1 → 1:3 → 纯树脂，每步 30 分钟到数小时不等，最后在纯树脂里过夜渗透。渗透不充分会导致包埋块切出来有空洞，切片完整性无从谈起。
包埋与聚合
渗透完成后，将样品转移到包埋模具中，加入新鲜树脂，放入烘箱聚合。Epon 812 的标准聚合条件是 60℃ 48 小时;Spurr 低粘度树脂可以 70℃ 24 小时。聚合温度和时间必须严格遵守——温度过高树脂变脆，切片时刀痕密集;温度过低聚合不完全，切片时样品粘连刀面。
切片与染色
聚合完成后，用超薄切片机(通常是 Leica UC/UCT 或 RMC Boeckeler)切 60~80 nm 的薄片，漂在水面后捞到铜网上。
常规染色用醋酸铀(染色脂类和核酸)和柠檬酸铅(染色蛋白质和糖类)双染。铀用醇溶液配制避免沉淀，铅染液容易和空气中的 CO₂ 形成碳酸铅沉淀，所以操作时要在铜网上覆盖一片蜡纸，同时在旁边放一碗 NaOH 吸收 CO₂。
结语
透射电镜细胞制样流程中，最容易出问题的环节是取材速度、锇酸后固定和树脂渗透这三步。任何一个环节的操作失误都会在最终图像里暴露无遗——膜结构模糊、线粒体脊断裂、细胞器空泡化，这些都是典型的制样伪影。如果在制样过程中遇到了具体困难，比如某种特殊细胞器的固定效果不理想，可以到科研学术网的科研测试专栏交流经验。
